Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego w płynie ocznym pacjentów z retinopatią cukrzycową i innymi zaburzeniami siatkówki cd

Dodano sto mikrolitrów roztworu zawierającego 2 x 104 cpm wyznakowanego 125I przeciwciała monoklonalnego anty-VEGF165 2E3 (podobnego do przeciwciała A4.6.124) i płytki inkubowano przez dwie godziny w 25 ° C z delikatnym mieszaniem. Supernatanty odrzucono, płytki przemyto, a studzienki zliczono za pomocą scyntygrafii gamma (licznik gamma LKB, Gaithersburg, MD). Stężenia VEGF oznaczono ilościowo ze standardowej krzywej dla VEGF z dopasowaniem czteroparametrowym (Kaleidagraph, Synergy Software, Reading, Pa.). Czułość testu wynosiła 0,05 ng na mililitr. Współczynniki zmienności w okresie próbnym i między testami wynosiły odpowiednio 5 i 6 procent. Próbkom płynu do oka z niewykrywalnymi stężeniami VEGF w tym teście lub testem wiązania receptora (opisanym poniżej) przypisano wartości 0,05 ng na mililitr. Test wiązania wiązania z receptorem
Procedura testu wiązania receptora była podobna do tej stosowanej w teście radioimmunologicznym, z tą różnicą, że zastosowano białko chimeryczne znakowane 125I podobne do kinazy tyrozynowej kinazy tyrozynowej (Flt-1), zamiast wyznakowanego 125I przeciwciała monoklonalnego anty-VEGF 2E3. . Monoklonalne przeciwciało anty-VEGF 5F8 stosowane do powlekania płytek nie wpływa na wiązanie ligand-receptor. Flt-1 jest receptorem VEGF o wysokim powinowactwie25. Całą całą domenę zewnątrzkomórkową (758 reszt) sklonowano przez łańcuchową reakcję polimerazy z polimerazą Pfu i poddano fuzji z sekwencją kodującą dla aminokwasów 216 do 443 klonu łańcucha ciężkiego IgG.1, 26, jak opisano w Park et al27. Receptor chimeryczny ma takie samo powinowactwo do VEGF, co pełnometrażowy receptor VEGF. Czułość i zmienność tego testu były podobne do czułości testu radioimmunologicznego.
Oznaczenie wzrostu komórek śródbłonka naczyń siatkówki
Bydlęce komórki śródbłonka z mikronaczyń siatkówki wyizolowano przez homogenizację i szereg etapów filtracji, jak opisano w innym miejscu28. Pierwotne hodowle hodowano w naczyniach powleczonych fibronektyną (NYBen Reagents, New York Blood Center, Nowy Jork) zawierających zmodyfikowaną pożywkę Eagle a Dulbecco z 5,5 mM glukozy, 10 procent surowicy końskiej (Wheaton, Pipersville, PA), 50 mg heparyny na litr i 50 jednostek czynnika wzrostu komórek śródbłonka na litr (Boehringer Mannheim, Indianapolis). Po konfluencji hodowli zmieniono pożywkę na 5 procent surowicy płodowo-cielęcej (Hyclone, South, Utah). Komórki były karmione co trzy dni. Homogenność komórek śródbłonka została potwierdzona przez przeciwciała anty-czynnik VIII. W celu przeprowadzenia testu komórki wysiano rzadko (2500 komórek na studzienkę) na 24-studzienkowe płytki (Costar, Cambridge, MA) i inkubowano przez noc w pożywce Eagle a zmodyfikowanej przez Dulbecco zawierającej 10 procent surowicy cielęcej (GIBCO, Grand Island, NY). Pożywki zostały zmienione następnego dnia i dodano VEGF lub płyn szklisty (końcowa objętość, 15 do 25 procent), z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub 1- do 10-krotnym nadmiarem neutralizującego VEGF króliczego przeciwciała poliklonalnego. Po inkubacji w 37 ° C przez cztery dni komórki lizowano w 0,1% dodecylosiarczku sodu, a zawartość DNA mierzono barwnikiem (Hoechst 33258, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco) i fluorometrem (model TKO-100, Hoefer )
[podobne: przekłuwanie uszu pielęgnacja, fala uderzeniowa wskazania, koronki cyrkonowe ]

Dodaj komentarz

Twój adres email nie zostanie opublikowany. Pola, których wypełnienie jest wymagane, są oznaczone symbolem *

Powiązane tematy z artykułem: fala uderzeniowa wskazania koronki cyrkonowe przekłuwanie uszu pielęgnacja